Downstream Teil 1
Meine erste Folie, mit der ich zufrieden bin und die mir zeitgleich Angst macht.
Einleitung:
Ein langes Vorwort um die generelle Problematik erst einmal zu erörtern
Dieses Substack dürfte - selbst für meine Verhältnisse - monströs werden. Darum werde ich es in einzelne Teile fragmentieren.
Wie immer baue ich langsam Schritt für Schritt auf, was sich aus gängigen Thesen, Beobachtungen und Reviews ableiten lässt und kombiniere diese zu einer Gesamtbetrachtung. Es ist - meiner bescheidenen Meinung nach - unerlässlich, summierende Hypothesen aufzustellen, die sich möglichst nahe an gängigen Termini und genauer Erörterung dieser entlang bewegen. Dabei ist es ebenfalls unerlässlich, zu erörtern, WO der ganze “Spaß” anfängt, da alles danach ja nur noch kumulierende Effekte darstellt. Und erst mit der Vogelperspektive auf verschiedene Mechanismen und deren gegenseitige Beeinflussung (Crosstalks) ist es möglich, ein Verständnis für diese Spritzen aus der Hölle zu bekommen. Und da ich nun mal der Nerd bin, der sich auf die Signaltransduktionskaskaden versteift hat, versuche ich mit diesem Substack und meiner Folie einen bescheidenen Beitrag dazu beizusteuern. Ich werde mich jedoch langsam an die Sache rantasten und bitte schon mal jetzt um Verzeihung, falls es dem ein oder anderen zu expansiv wird.
Für die, die also keine Geduld haben: Die Papers, die meine Hypothese stützen zu den LNPs (Augenmerk auf BNT162b2) gibt es ganz am Schluss.
Wir gehen heute bis ganz tief downstream, ohne Anspruch auf Vollständigkeit der Mechanismen und einiger Simplifizierungen. So werde ich beispielsweise auf den gesamten Myd88-Trif-Tram-TIRAP-TLR-Komplex und all die anderen hübschen Downstreamkaskaden der PRRs verzichten und die Bedeutung der Mitochondrien und mitochondrialer Schäden. Letzteres werde ich nur hier in der Einleitung kurz anreißen. Meine Folie, die ich als Aufmacher oben drüber zeige, wird euch in diesem Substack - wenn es passt - noch öfter begegnen, da ihr mit der Lektüre, die ich zitiere, vergleichen müsst.
Ich werde also versuchen, eine grobe und schematische Reihenfolge der Prozesse auszuarbeiten, die als allererste Schadenskaskade abläuft, noch bevor es zum Totalausfall der transfizierten Zellen und der Upstreamkaskaden, Feedbackloops und daraus resultierenden Downstreamkaskaden kommt, damit es hoffentlich endlich verstanden wird: Wieso ich weder einen kontrollierten Zelltod (Apoptose) für die meisten Zellen sehe, noch große Chancen auf Pyroptose oder Nekrose (bzw. all die anderen Subarten von Zelltod). Deshalb würde ich nur für die am heftigsten beschädigten Zellen in den transfizierten Endothelzellen, Epithelzellen, Kupfferzellen und den Immunzellen (Dendritische Zellen und Monozyten) eine Form von diesen Zelltoden vermuten.
(*2) Dies ist schon alleine logisch aufgrund der höchstwahrscheinlichen Mitochondriopathie (das heißt beschädigten Mitochondrien) in den meisten transfizierten Zellen.
Mitochondrial oxidative stress, mitochondrial ROS storms in long COVID pathogenesis
Histological and serological features of acute liver injury after SARS-CoV-2 vaccination
Und der vorzeitige Zelltod benötigt sehr viel Energie. Das heißt effektive Mitochondrien:
“Zellen brauchen Energie nicht nur zur Aufrechterhaltung ihrer lebenswichtigen Funktionen, sondern auch, um in Würde sterben zu können.”
”Die Permeabilisierung der mitochondrialen Außenmembran (MOMP) ist ein entscheidendes Ereignis bei der Durchführung der Apoptose. Sie ist außerdem über verschiedene Mechanismen mit einem Rückgang der bioenergetischen Funktion verbunden, der nicht nur auf die Dispersion von Cytochrom c zurückzuführen ist. Der MOMP-induzierte bioenergetische Mangel ist in der Regel irreversibel und führt zum Absterben der Zellen, auch wenn die Caspasen inaktiv sind.”
Mitochondria – judges and executioners of cell death sentences
[Wichtig für folgendes Zitat: Bcl-2 ist ein (Zelltod)-Regulatorprotein, das von Tumorzellen überexprimiert wird, was die Apoptose der Zellen verhindert.]
“Während den Wechselwirkungen zwischen den Bcl-2-Proteinen viel Aufmerksamkeit gewidmet wird, sind in den letzten Jahren Daten aufgetaucht, die darauf hindeuten, dass Merkmale der Mitochondrien selbst die zelluläre Verpflichtung zur Apoptose beeinflussen. Zu diesen Merkmalen gehören die Lipidzusammensetzung, die Größe der Mitochondrien und die Lage der Mitochondrien im Verhältnis zu anderen Organellen. Die Lipidumgebung der äußeren Mitochondrienmembran ist der vorherrschende Ort für Interaktionen zwischen der Bcl-2-Familie. Diese Umgebung ist sogar so wichtig, dass sich die Interaktion kleiner Moleküle, die Bcl-2-Proteine nachahmen, in Lösung und in einer Membranumgebung unterscheiden kann (Aranovich et al., 2012). Darüber hinaus kann die genaue Lipidzusammensetzung der Mitochondrien auch die zelluläre Empfindlichkeit für Apoptose verändern. So scheint beispielsweise der zelluläre Gehalt an Sphingomylenase die MOMP zu fördern (Chipuk et al., 2012). Die Lipidzusammensetzung der Mitochondrien kann auch die Aktivität bestimmter pro-apoptotischer Proteine begünstigen. So wird beispielsweise tBID” [truncated BH3 interacting domain death agonist - Ein Familienmitglid der BCL2-Proteine] “in Membranen mit Cardiolipin besser rekrutiert und erfährt Konformationsänderungen (Shamas-Din et al., 2015). Nicht nur die mitochondriale Lipidzusammensetzung beeinflusst die Apoptose, sondern auch die Morphologie und Größe der Mitochondrien kann die Empfindlichkeit gegenüber MOMP bestimmen (Pyakurel et al., 2015; Renault et al., 2015).”
Als hätte ich es gerochen, warum ich diesen Höllenritt erst jetzt antrete:
The interplay of p38 MAPK signaling and mitochondrial metabolism, a dynamic target in cancer and pathological contexts (leider hinter einer Bezahlschranke doch folgende Textschnipsel sollten verdeutlichen, wieso ich die Mitochondrien nur kurz anschneiden will)
“Es gibt immer mehr Belege dafür, dass die p38-MAPKs zu den wichtigsten Vermittlern der zellulären Apoptose gehören [57]. Im Allgemeinen kann die Apoptose über extrinsische (durch Todesrezeptoren vermittelte) Wege oder intrinsische (mitochondriale) Wege erfolgen, bei denen die Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran ein wichtiger Schritt ist [79]. Im Falle der von der Permeabilitätsübergangs-Pore (PT) abhängigen Apoptose wird der durch den Elektronentransport in der ETC erzeugte Protonengradient bei der Öffnung der Pore abgebaut.“ [ETC = Elektronentransportkette]
“Die Interaktion zwischen p38 und der mitochondrialen Funktion hat erhebliche Auswirkungen auf die Krebsentstehung und -progression. Neben der wichtigen Rolle des p38-MAPK/PGC-1-α-Signalwegs bei der Förderung von MB und oxidativer Phosphorylierung zur Regulierung der metabolischen Reprogrammierung kann die Dysregulation der p38-MAPK-Signalübertragung zu einer abnormen mitochondrialen Dynamik führen. Solche Störungen beeinträchtigen den zellulären Energiestoffwechsel und tragen weiter zur genomischen Instabilität, zum Redox-Ungleichgewicht und zur Umgehung der Apoptose bei - alles Kennzeichen von…” → Krebs, ach ne, äh, bestimmt megagesunde Zellprogression?
Was könnte also schon schiefgehen?
Kurzum: Es wird nur in den ersttransfizierten Zellen, die genug Schaden abbekamen überhaupt noch der Zelltod stattfinden, was dann auch die Tight Junctions-Auflösung und die Durchlässigkeit für alle möglichen Blutschranken (*1) erklären dürfte, da diese auf die Integrität der Membrane angewiesen sind. Das würde (später mehr dazu) diesen gruseligen T-Zell drop, den wir bei Rishi R. Goel et al. sahen, logisch und plausibel erklären (*3).
Ihr erinnert euch vllt. noch?:
mRNA vaccines induce durable immune memory to SARS-CoV-2 and variants of concern
Fragt sich gerade noch jemand, wie es nach mehr als 6 Monaten aussähe?
Endothel und Epithelzellen werden höchstwahrscheinlich nur zu gerne als Transfektionsziel dienen. Warum schreibe ich höchstwahrscheinlich? Weil wir es nicht wissen! Erinnert ihr euch an die FOI-Daten der TGA?:
https://tga.gov.au/sites/default/files/foi-2389-06.pdf (*1)
Sie verfolgten nur via Luziferaseassay die modRNA. (Ich glaube es war nicht mal die Spike-modRNA, da sie nur mRNA schreiben.) Heißt also, dass hier nur die modRNA-Expressionsraten (nicht aber, wie viele und welche Zellen tatsächlich transfiziert wurden) gezeigt werden. Darum können wir uns also nur an gängiger, existenter Lektüre orientieren
Endothelzellen
Lipid Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery to Endothelial Cells (injiziert in Mäuseherzen)
“Die intravenöse Verabreichung von Lipid-Nanopartikeln ist der gängigste Weg, um Endothelzellen mit therapeutischen Genen zu versorgen, da sich diese Zellen auf der Innenseite der Blutgefäße befinden und in direktem Kontakt mit dem Blut stehen.”
“Die direkte Injektion von mRNA in Mäuseherzen führte zu einer robusten Transfektion von Endothelzellen, Kardiomyozyten und glatten Muskelzellen. Interessanterweise verbesserte mRNA, die für VEGF-A kodiert, das Überleben in einem Mausmodell mit Myokardinfarkt effizienter als DNA. Dies wurde auf eine anhaltende, DNA-vermittelte VEGF-A-Expression zurückgeführt, die zu einer größeren Gefäßleckage führte, und unterstreicht den Vorteil einer akuten Transgenexpression, die mRNA bei bestimmten Anwendungen bietet.”
Lipid nanoparticles for mRNA delivery
“So wurde beispielsweise mittels Barcoding untersucht, wie sich die Struktur von Cholesterinderivaten auf die Zellselektivität von Lipid-Nanopartikeln auswirkt. Dabei zeigte sich, dass die selektive Anreicherung in Leberendothelzellen, Kupffer-Zellen und Hepatozyten von den Cholesterinstrukturen abhängt. Solche großen Datensätze werden den Weg für ein tieferes Verständnis der Beziehung zwischen den Eigenschaften von Lipid-Nanopartikeln und ihrer biologischen Verteilung ebnen.”
Evaluating how cationic lipid affects mRNA-LNP physical properties and biodistribution
“Wir stellten die Hypothese auf, dass positiv geladene zirkulierende mRNA-LNPs mit einer Partikelgröße von weniger als 100 nm wahrscheinlich in der Lunge gefangen werden und an die anionische Endothelzellenoberfläche binden, was den Zelleintritt und die Nukleinsäureabgabe ähnlich wie bei Lipoplexen oder Polyplexen erhöht. Um diese Hypothese zu überprüfen, mussten wir zunächst ein neues kationisches Lipid synthetisieren, das im Vergleich zu den wichtigsten dauerhaft geladenen kationischen Lipiden, DOTMA und DOTAP, weniger toxisch ist. Zu diesem Zweck entfernten wir die Ladung des quartären Ammoniums und synthetisierten einen neuen N-Heterozyklus, Imidazolium, der die Ladung trägt. Wir haben zuvor die Effizienz dieser Molekülfamilie bei der In-vitro- und In-vivo-Transfektion von mRNA durch Liposomen nachgewiesen. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde IM21.7c ausgewählt, um die Verwendung von Imidazolium in mRNA-LNP-Formulierungen zu untersuchen. Es wurde eine 7-stufige Synthese entwickelt, um IM21.7c mit einer Gesamtausbeute von 37,2 % herzustellen (Schema 1).”
“Wir haben Zebrafischembryonen als zuverlässiges In-vivo-Modell verwendet, da sie nachweislich mehrere anatomische und physiologische Merkmale mit ihren Säugetieräquivalenten gemeinsam haben; daher wurden Zebrafischmodelle ausgiebig zur Bewertung der Toxizität, der biologischen Verteilung, des Blutkreislaufs und der Zielfähigkeit von Nanomedikamenten, einschließlich LNPs, verwendet [31], [50]. 24 Stunden nach der Injektion stellten wir fest, dass die LNPs aus dem Blutkreislauf entfernt wurden und sich in Endothelzellen sowie im extravaskulären Raum im gesamten Körper des Zebrafischembryos anreicherten, wie in Abb. S5b gezeigt.“
Witzig!: Wir haben also Milliarden Menschen mit einer Plörre transfiziert, bei der wir gerade mal anfangen, Modelle zur Biodistribution an Zebrafischembryonen zu entwickeln.
Epithelzellen
Diese Studie ist insoweit interessant, dass sie SM-102 (Mod[e]RNA) vergleicht und feststellt, dass ihre Lipidformulierung angeblich wesentlich weniger off target transfiziert. Dazu sage ich mal ein fettes NARF!
Structure and Function of Cationic and Ionizable Lipids for Nucleic Acid Delivery
“Die Struktur kationischer Lipide wurde auch mit fluorierten Lipiden verändert, um die Effizienz von LNP-Formulierungen mit Hilfslipiden zu erhöhen. So synthetisierten Vierling et al. eine fluorierte Version von DOTMA, bei der eine oder beide Lipidketten fluoriert waren. Die fluorierten kationischen Lipide konnten DNA mit oder ohne DOPE kondensieren, um fluorierte LNP zu bilden, die eine geringe Zytotoxizität und hohe Effizienz bei der Transfektion von Lungenepithelzellen aufwiesen.”
mRNA nanodelivery systems: targeting strategies and administration routes
“Außerdem ist die PEGylierung bei erkrankten Lungen entscheidend für die gezielte Verabreichung von mRNA-LNPs in die Lunge. In einem Mausmodell für Lungenfibrose transfizierten neutrale, oberflächengeladene mRNA-LNPs, die durch PEG-Lipide erleichtert wurden, sowohl Alveolarepithelzellen als auch Lungenfibroblasten durch intranasale Verabreichung. “
Was sind denn “Host cells”, liebe Autoren? Also ihr habt hier auch Epithelzellen genommen, richtig?
Intramuscular mRNA BNT162b2 vaccine against SARS-CoV-2 induces neutralizing salivary IgA
Myteriös, mysteriös, liebe Autoren. Es sei denn man würde folgende Paper und zirkulierende Epithelzellen berücksichtigen:
Detection and Analysis of Circulating Epithelial Cells in Liquid Biopsies From Patients With Liver Disease (Helft mir doch mal kurz auf die Sprünge: Wohin geht ein Haufen der LNPs konzentriert? Wird schon nicht die Leber sein.)
Circulating progenitor epithelial cells traffic via CXCR4/CXCL12 in response to airway injury (Ach, mach Sachen?! Was würde wohl bei systemisch zirkulierenden LNPs geschehen, wenn sie das ein oder andere Lungenepithel träfen?)
Ach mach Sachen? Das Paper ist von 2023 und es wurde seitdem absolut Nichts unternommen, um in die Epithelzellen und Endothelzellen von Transfizierten zu gucken, ob diese das Spike expressieren oder modRNA gefunden würde und/oder Membranalterationen (Rezeptorexpressionen/reaktivität) und/oder endosomale Schäden, was auf eine Transfektion hinweist. Darum betonte ich auch, dass ich nur von gängiger Lektüre, die verschiedenste “Host cells”™ aufzeigt, ausgehen kann.
Immunzellen? (Dickes Fragezeichen)
Gene transfection efficiency into dendritic cells is influenced by the size of cationic liposomes/DNA complexes (Thymus, Lymphorgane und Knochenmark)
Monozyten (TGA) (Knochenmark und systemisch im Blut zirkulierend)
Dies also erst einmal zum Grundverständnis, wieso ich nur allgemein die Transfektionskette downstream verfolgen möchte und nicht auf absolute Eigenarten von organspezifischen Epithelzellen eingehen möchte, welche meines Erachtens und meines Grundverständnisses von LNPs nach am wahrscheinlichsten Hauptherd der Transfektion, nebst Endothelzellen sein werden.
Siehe auch EMA (Europäische Arzneimittelbehörde) [ https://ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/spikevax-previously-covid-19-vaccine-moderna-epar-public-assessment-report_en.pdf ], um diese Hypothese zu stützen.
Insgesamt, ließe sich also bis hier hin festhalten, dass die Wahrscheinlichkeit der transfizierten Zelltypen extrem von der stark schwankenden und noch dazu vermutlich signifikant chargenabhängigen Größe der Lipidnanopartikel (die Zusammensetzung der einzelnen Lipide, die genutzt wurden) und dem PKa-Wert abhängt.
Eine der wenigen wirklich sauber gemachten Biodistributionsstudien, die wir derzeit haben, falls ihr mehr über diese Zusammenhänge begreifen möchtet, die ich empfehlen kann:
Noch ein kleiner Funfact zum Thema transfizierte Epithelzellen und, wieso ich nicht davon ausgehen kann, dass diese in Zelltod untergehen werden:
Revisiting Epithelial Carcinogenesis
“Die Hypothese beschreibt die Karzinogenese als Ergebnis der Dedifferenzierung von Epithelzellen in der Hyperplasie aufgrund replikativer Seneszenz in einen mesenchymalen Zellzustand mit potenziell krebsartigem Verhalten. Zur Untermauerung dieser Hypothese wurden die molekularen, zellulären und histopathologischen Belege kritisch überprüft und gegebenenfalls neu interpretiert, um eine plausible allgemeine Reihe von Mechanismen für die Entstehung und das Fortschreiten von Karzinomen zu postulieren.”
Dieses wirklich expansive Review- welches sich mit der gängigsten Theorie, dass Epithelzellen der Haupttreiber für Karzinome, Melanome, etc. sind, ist wirklich sehr, sehr lesenswert.
(*2) Und natürlich wäre ich nicht ich, wenn ich nicht vielen Wissenschaftlern widersprechen würde, von denen ich eigentlich mein Basiswissen durch ihre großartigen Beiträge erlernte und darauf aufbauend erweitern konnte: Was viele dieser tollen Menschen leider völlig unterschätzen, wenn sie die gängige These vertreten, dass durch die Zytotoxizität der transfizierten Zellen der Zelltod als unausweichliche Konsequenz drohe: So arbeitet das gesamte Immunsystem leider nicht, da jede einzelne Zelle für sich eine autarke Kleinsteinheit des Lebens darstellt und auf so heftige Irritationen, wie die bei der Transfektion ausgelösten, meiner bescheidenen Meinung jedenfalls nach, nicht mehr die gewohnten Prozesse durchlaufen wird. Siehe auch meine kurze Ausführung zu den Mitochondrien.
Escaping Death: How Cancer Cells and Infected Cells Resist Cell-Mediated Cytotoxicity
"Die Umgehung der Lymphozytenzytotoxizität kann jedoch auch nach der Aktivierung der Immunzellen erfolgen. Selbst wenn eine zytolytische Reaktion durch die Lymphozyten ausgelöst wird, sind die Zielzellen keine passiven Zuschauer der Lymphozytenzytotoxizität. Denn die Mechanismen des Zelltods beruhen in der Regel auf einer aktiven, den Zelltod fördernden Signalgebung innerhalb der Zielzelle. Die Umgehung des Zelltods und der Apoptose wird als ein entscheidendes Merkmal von Krebs angesehen. Daher kann eine Resistenz gegen Lymphozytenangriffe durch eine Resistenz gegen die Mediatoren der Zytotoxizität, einschließlich Perforin, Granzyme und Todesrezeptor-Liganden, entstehen."
(*3) Und genau das würde dann eben auch einen T-Zelldrop auf Dauer erklären: Da die T-Zellen sich, wenn sie überstrapaziert werden, aufreiben und erschöpfen. Siehe Lektüre zu “T-Cell exhaustion”. Selbiges gilt auch für die B-Zellen und NK.
2 Beispiele dazu für ADCC ohne zusätzlich näher auf diese Phänomene eingehen zu wollen:
Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity (ADCC) in Familial Myalgic Encephalomyelitis/Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) (Hashtag Long lie, äh, Verzeihung, long covid).
Bevor ich nun Schritt für Schritt dem Grundgedanken der Transfektion folgen werde und vielen der Signaltransduktionswege, die affektiert sein werden, folge… Noch ein kurzes Wort: Aktives Mitdenken wird - wie bei meinen meisten Substacks - notwendig sein. Da ich es in einer aktiven Hypothese festhalten werde, die sich während des Schreibens und “die wichtigsten Papers wiederfinden” (aus ungefähr 1k - 1.5k seit drei Jahren), die ich las, entwickelt.