Die Mutter aller Bomben

Ein tiefes Dankeschön an Maria Gutschi.

Maria stieß mich gerade auf ein endlos verstörendes Paper, dass ich dann doch mal ein wenig besprechen muss. Doch dazu müssen wir erst einmal wieder in die leidige Frage eintauchen: Wie viele LNPs sind denn nun eigentlich in einem Schuss BNT162b2 (ALC-0315) und Moderna (SM-102) drin?!

MHRA (Medicines and Healthcare products):

Freedom Of Information Act

(“Keine Ahnung, wie viele LNPs in so einem Schuss sind. Ist irrelevant.” [Moderna])

Das einzige Paper, welches ich überhaupt zu Massen - und Zahlenangaben der LNPs fand:

Kinetics of COVID-19 Vaccine Ionizable Lipids in Human Blood

“SM-102 is a nonhuman ionizable lipid used to interact with mRNA in the lipid nanoparticle formulation of the Moderna SPIKEVAX mRNA vaccine. Since SM-102 has a structure that is distinct from endogenous human lipids, a mass spectrometry-based lipidomics method was developed to detect and quantify SM-102 lipids in human plasma (Figure 1c, see the Methods section for details). SM-102 background signal was determined in plasma without SM-102 (collected prevaccination), and levels were detected above background (range 0.39–8.39 ng mL^–1) in the plasma of all 19 Moderna vaccine subjects at 4 h postvaccination (Figures 1d, S1d, and S3). SM-102 levels peaked at 4 h to 2 days (mean 1.1 day) postvaccination (median 3.22 ng mL^–1) and subsequently showed log-linear decay kinetics. The SM-102 signals remained significantly above the background at day 4 postvaccination (up to 1.16 ng mL^–1) and approached background levels by day 7 postvaccination (up to 0.12 ng mL^–1).”

Na hoppala. 0,12ng/mL würde ich jetzt nicht als Background bei einer solch synthetischen Abartigkeit betiteln, liebe Autoren.

“Representative image showing the peak intensity of SM-102 signals in a set of plasma samples from a subject at day 0–6 postvaccination determined by liquid chromatograph mass spectrometry. (d) Longitudinal SM-102 ionizable lipid concentrations in the plasma of the 19 subjects.”

Insbesondere dann nicht, wenn, wie ihr schreibt, ihr die Signale nur im Plasma nach Blutentnahme verfolgt habt. Und erst recht nicht, wenn ihr nur mit einfachem CMS gearbeitet habt!

Nachdem wir nochmal geklärt haben, dass wir nicht mal die Anzahl der LNPs pro Dosis oder zumindest Flasche kennen und man getrost auf 10^10 bis 10^13 schätzen kann: Machen wir uns an die Arbeit.

Zunächst schauen wir uns noch mal die Struktur der beiden tertiären Amine an:

Paging Erin Brockovitch

Structural characterization of the cationic lipid nanoparticle component, ALC-0315, and its impurities using electronactivated dissociation (EAD)-based MS/MS fragmentation

Die Peaks die ihr hier seht, lassen insgesamt, wenn ihr das Paper weiterlest darauf schlussfolgern, dass 0,19% Oxidierte ALC-0315-Verunreinigungen in einer frisch geöffneten Flasche ALC-0315 gefunden wurden. Noch dazu stellen die Autoren fest, dass sie nicht in der Lage waren, festzustellen, ob auch die tertiären Aminköpfe oxidiert waren. Macht ja nichts, ist ja nur der kritischste Part der LNPs: nicht einmal vollständig analysiert, geschweige denn ausgeschlossen.

0,19%? Pah! Ist doch ne Kleinigkeit und irrelevant. Und jetzt kommt der Witz: 10^10 bis 10^13 x 46.3 [BNT162b2]/ 50[mRNA1273]:

Lipid nanoparticles in the development of mRNA vaccines for COVID-19

"The molar ratios of the positively charged lipid:PEGylated lipid:cholesterol:DSPC are 46.3:1.6:42.7:9.4 and 50:1.5:38.5:10 for the BNT162b2 and mRNA-1273 vaccines respectively [37,73]."

Detection of aldehydes from degradation of lipid nanoparticle formulations using a hierarchically-organized nanopore electrochemical biosensor

Sicherlich vergaßen die Autoren hier lediglich anzumerken, dass SM-102 nicht oxidiert sein sollte, noch bevor es zum Abbau kam?

Und genau hier liegt auch die Mutter aller Bomben begraben: Maria machte mich, wie bereits erwähnt, auf folgendes Paper aufmerksam:

The Chemical Reactivity of Membrane Lipids

„Peptide ohne grenzflächenreaktive Gruppen, wie z. B. Penetratin, reagieren nur unter ganz bestimmten Umständen, wie z. B. bei hohen Salzkonzentrationen. Weitere Gruppen in Melittin reagieren ebenfalls mit Lipiden, vor allem das Hydroxyl der Seitenkette von S18, um estergebundene lipidierte Peptide zu bilden, aber die Reaktivität dieser Gruppen ist geringer als die der Amine.“

Ich versuche es mal “einsteigerfreundlich” zu formulieren: Was die Autoren in ihrem beeindruckenden Review hier festhalten, ist der Umstand, dass es bestimmte Stoffe gibt, die wesentlich reaktionsärmer sind. Warum dieser Passus so mordswichtig ist: Die stärkste direkte Lipid-Interaktion (das heißt eben nicht nur reagiert mit, sondern beeinflusst auch das gesamte Membran-lipid-Mosaik) haben Amine.

“2.2.4. Die Auswirkungen von Membranadditiven

"Es gibt einige bemerkenswerte Abweichungen vom vorhergesagten hydrolytischen Verhalten, vor allem bei amphiphilen…” [sowohl hydro- als auch lipophil] “…Stoffen wie Aminen mit titrierbaren Gruppen, die bei neutralem pH-Wert ionisiert sind. Erhöhte Raten in Gegenwart von Ascorbylpalmitat wurden bereits festgestellt. Dialkylphosphate haben einen signifikanten Einfluss auf die Geschwindigkeit der Lipidhydrolyse in einer Weise, die von der Kettenlänge abhängt und zu schnelleren Raten führt, wenn die Länge der Alkylkette ähnlich der des Lipids ist. Bei H-SoyPC/Dipalmitoyl-Liposomen (10:1) waren beispielsweise nach 28 Tagen (40 °C, pH 7,5) noch 77 % des Lipids vorhanden, verglichen mit ≥20 % bei Didecyl- und Dieicosylphosphat und 96 % in Abwesenheit des Dialkylphosphats. Interessanterweise wurde in diesem System auch eine signifikante Hydrolyse des Lysolipids beobachtet. Der Einbau von Cholesterin erhöhte die Hydrolyseraten unterhalb der Tm von DPPC und verringerte die Raten oberhalb der Tm. Sowohl in DPPC/DOPE (3:1) als auch in 1,2-Dioleoyl-3-trimethylammoniumpropan (DOTAP)/1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE) (1:1) Membranen ist die Hydrolysegeschwindigkeit beider Komponenten unterhalb von pH ∼6,5 nahezu pH-unabhängig, was auf die vorherrschende Katalyse durch die geladene Ammonium-Kopfgruppe zurückgeführt wird."

Je nach Schwanzlänge und - vermutlich (wie im ALC-0315 paper mit dem verzweigten Fettschwanz gezeigt - auch von der Teilung des Schwanzes abhängig) wird bereits massivst in die Interaktionsmöglichkeit mit anderen Lipiden eingegriffen (Packungsdichte, Membranfestigkeit und Reaktivität). Darüber hinaus halten sie fest, dass das Cholesterolverhältnis in der LNP-Formulierung massivst auf die Hydrolyseraten schmelzpunktabhängig (Tm) eingreift. Aber hey: ist doch nur ne Fettkugel. Und sicherlich ist es nicht weiter erwähnenswert, dass jedes Cholesterol zusätzlich die Hydrolyserate unterhalb der Schmelztemperaturen erhöhte. 28 Tage aktive Hydrolyse ist auch nicht weiter schlimm. Fest versprochen.

Und jetzt kommt der absolute, äh, “Mother of all bombs”-Moment:

“Wenn primäre Amine in der Membran vorhanden sind, z. B. in Lipiden wie Sphingosin, kann es zu einer Vernetzung durch Iminbildung mit reaktiven Aldehyden kommen, die anschließend die Vesikelaggregation vorantreiben kann.”

Herzlichen Glückwunsch!: Sie haben sich gerade ihren Endosom-Lysosom-Phagosom-Kreislauf zerschossen und ne matschige Umstrukturierung der Membran und alles, wofür sie steht (inklusive Rezeptorfunktionalität) gab es gratis dazu.

Zu scharf formuliert? Ich versuche es mal noch etwas präziser und nüchterner: Vesikelaggregation meint das Ineinanderverklumpen von Vesikeln (beispielsweise Lysosome). Und da wir ja mittlerweile wissen, dass die Membranstruktur und Integrität durch den Zyklus dieser Prozesse restrukturiert wird und wir bei ALC-0315 von einem ionisierbaren tertiären Amin reden, könnt ihr euch hoffentlich an einer Hand ausrechnen, wohin diese Reise geht. Und warum war jetzt der oxidative Zustand so wichtig, dass ich zuerst diesen betonte?:

“Oxidierte Lipide werden mit der Bindung an eine Reihe von Rezeptoren in Verbindung gebracht, darunter G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, die mit der Entzündungsreaktion in Verbindung stehen (Thrombozyten-aktivierender Faktor-Rezeptor), nukleare Rezeptoren, die mit dem Lipidstoffwechsel in Verbindung stehen (Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptoren, PPARα), und Rezeptoren, die mit der angeborenen Immunität in Verbindung stehen (CD14 und Toll-like-Rezeptoren).(536) Von PUFAs abgeleitete Lipide können die Gefäßrelaxation, die Aktivität von Kalziumkanälen vom L-Typ und die Glukosehomöostase beeinflussen.(536) Von PUFAs abgeleitete Lipide können die Gefäßrelaxation, die Aktivität von Kalziumkanälen vom L-Typ und die Glukosehomöostase beeinflussen.”

Eigentlich sollte dieser Passus - so hoffe ich zumindest - selbsterklärend sein.

Fassen wir also zusammen: dieses Review bestätigt alles, was ich immer und immer wieder sagte: Ihr habt euch den gesamten PtdIns-Zyklus weggehämmert, da dieser untrennbar in Membranorganisation/reorganisation und Endsom-Lysosom-Phagosom-Regulation involviert ist und es wird hier so brutal bestätigt und auch die schleichende Toxizität, die fernab von bekannten messbaren Größen abläuft, dass ich nur noch beten kann, dass nicht in jedem Fläschchen wirklich LNPs drin waren.

Und damit nicht genug, habt ihr gleich zwei randomisierte zerstörerische Prozesse zum Preis von einem: zum einen eine direkte - endozytoseähnlich getriebene -Transfektionsmöglichkeit, vorrangig durch die Schmelztemperaturgeschichte des Cholesterols angetrieben und durch die ionisierbaren Lipide begünstigt. Und zusätzlich durch den Umstand, dass es tertiäre Amine sind auch noch direkte Rezeptorbindemöglichkeit.

Good narfing luck.

Addendum 14.04.2025

Hier ist meine bisherige Studiensammlung, die ich dann tatsächlich durchackerte, um zu einem so sarkastischen Tonfall zu tendieren, da es anders nicht mehr ertragbar wäre. Bei einigen Studien erlaube ich mir ein paar kritische Fragen und Anmerkungen:

Potentielle und garantierte Schadeffekte:

Vergleich Liposome und LNPs:

Lipid Nanoparticles─From Liposomes to mRNA Vaccine Delivery, a Landscape of Research Diversity and Advancement

Woher mein Sarkasmus rührt

Liposome

Cationic liposomal lipids: From gene carriers to cell signaling

Cationic lipids activate intracellular signaling pathways

Die LNPs

Ionizable lipids penetrate phospholipid bilayers with high phase transition temperatures: perspectives from free energy calculations

The mRNA-LNP platform's lipid nanoparticle component used in preclinical vaccine studies is highly inflammatory

Lipid nanoparticles enhance the efficacy of mRNA and protein subunit vaccines by inducing robust T follicular helper cell and humoral responses

Ionizable lipids penetrate phospholipid bilayers with high phase transition temperatures: perspectives from free energy calculations

Pro-inflammatory concerns with lipid nanoparticles

Lipid nanoparticles (LNP) induce activation and maturation of antigen presenting cells in young and aged individuals

Pre-exposure to mRNA-LNP inhibits adaptive immune responses and alters innate immune fitness in an inheritable fashion

The BNT162b2 vaccine’s empty lipid nanoparticle is able to induce an NF-κB response

Lipid Nanoparticle-Associated Inflammation is Triggered by Sensing of Endosomal Damage: Engineering Endosomal Escape Without Side Effects

Immunogenicity of lipid nanoparticles and its impact on the efficacy of mRNA vaccines and therapeutics

Tear of lipid membranes by nanoparticles

Engineering ionizable lipids for rapid biodegradation balances mRNA vaccine efficacy and tolerability

Lysosome toxicities induced by nanoparticle exposure and related mechanisms

“Nanoparticles distribute the acidity of lysosomal.

Nanoparticles disrupt lysosomal function by the regulation of ion channel proteins.”

(Hab doch gesagt: Verabschiedet euch von dem Gedanken funktionsfähiger PtdIns-Zyklen und nachgeschalteter Signaltransduktion?)

Protein corona formed on lipid nanoparticles compromises delivery efficiency of mRNA cargo

"This lack of mechanistic understanding limits future rational design. Moreover, these screening approaches face a high degree of complexity due to the theoretically infinite design space for LNP synthesis. Currently, these screens fail to predict how changes in particle function in the context of in vitro screens will translate to LNP function in cellular assays or resulting in vivo efficacy. Evidence has established a potential relationship between protein recruitment to the LNP surface and organ targeting and functionality necessitating further characterization of the interactions between proteins and LNPs."

(...)

"As such, we seek to explore how the LNP identity is redefined by the spontaneous adsorption of biofluid proteins, and how these LNP corona proteins impact their function. Upon injection, nanoparticles encounter various biological tissues and compartments. Biomolecules such as proteins spontaneously interact with the nanoparticles and form an associated protein corona. Proteins with a strong affinity for the particle surface form a “hard corona,” while more loosely associated proteins form a dynamic “soft corona”.These corona proteins modify nanoparticle function and localization in vivo, as this outer protein layer changes how nanoparticles interact with cell-surface receptors, impacting cell uptake and biodistribution.Upon systemic injection, most nanoparticles are cleared by the liver and, in particular for LNPs, adsorption of apolipoprotein E (ApoE) facilitates interactions with low-density lipoprotein receptors on the surface of hepatocytes to mediate intracellular delivery. By connecting protein corona formation and cellular delivery outcomes observed for LNP formulations, we can better understand how biomolecular interactions govern LNP transfection efficacy and design LNPs with favorable biomolecular interactions during library screening to optimize LNP function."

Role of Lipid Peroxidation-Derived α, β-Unsaturated Aldehydes in Vascular Dysfunction

Biodistribution

Investigating the stability of RNA-lipid nanoparticles in biological fluids: Unveiling its crucial role for understanding LNP performance

"While composition of serum proteins remains comparable, the distribution volume and time to reach certain tissues differ largely between zebrafish, rodent, non-human primate and humans [[3], [4], [5], [6]]. "

Ionizable Lipid Nanoparticles for In Vivo mRNA Delivery to the Placenta during Pregnancy

(Warum wurde DLIN ("MC3") als Kontrolle angegeben aber nicht in der Auswertung gezeigt?!) -> Zeigt nur mRNA via Luziferase -> Endosomaler Escape bei DLIN schlecht, aber hohe Transfektionsrate -> Kann DLIN und damit logischer Weise erst recht ALC-0315 und SM-102 mit (mod. geteiltem, ungesättigten Fettschwanz) die Plazenta transfizieren?!)

Establishing the Pharmacokinetics of Genetic Vaccines is Essential for Maximising their Safety and Efficacy (Nicht lineare Transfektion)

https://www.tga.gov.au/sites/default/files/foi-2389-06.pdf (Limitation: Luciferase Assay)

https://phmpt.org/wp-content/uploads/2022/03/125742_S1_M4_4223_185350.pdf

https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/spikevax-previously-covid-19-vaccine-moderna-epar-public-assessment-report_en.pdf

Nanocarrier imaging at single-cell resolution across entire mouse bodies with deep learning

"The signal decreased slowly during the first 72 hours and after 6 and 9 days the signals were further weakened to approximately levels of 18 and 7 times the signals obtained from animals injected with buffer control."

https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/comirnaty-epar-public-assessment-report_en.pdf

-> LC-MS/MS-Methoden: Limitation liegt in der Unfähigkeit die strukturelle Integrität oder biologische Aktivität der Lipide nachweisen zu können.

https://phmpt.org/wp-content/uploads/2022/03/125742_S1_M4_4223_185350.pdf

Zusammenfassung der Studie:

Die Studie zeigt eine allmähliche Verteilung des Tritium-markierten Lipids ([³H]-CHE), mit zunehmender Anreicherung in bestimmten Geweben, selbst 48 Stunden NACH intramuskulärer Injektion.

Blood Distribution of SARS-CoV-2 Lipid Nanoparticle mRNA Vaccine in Humans

Biodistribution of Lipid 5, mRNA, and Its Translated Protein Following Intravenous Administration of mRNA-Encapsulated Lipid Nanoparticles in Rats